经历与绿妖的大战后，蜘蛛侠彼得·帕克（扮演者是托比·马奎尔）为了保护自己和亲人不再与心爱的玛丽（由克尔斯滕·邓斯特饰演）在一起，因为他知道蜘蛛侠的身份会给他们带来巨大的危险。因此，帕克决定单枪匹马承担蜘蛛侠的责任。帕克忙于面对各种挑战：掌握超能力的运用，同时在超级英雄和普通大学生两重身份下保守秘密，小心翼翼地过着生活。帕克对玛丽的感情越来越深，但作为蜘蛛侠，他无法向她敞开心扉。好友哈利因误解蜘蛛侠而对他怀有敌意，而唯一的亲人婶婶也开始怀疑蜘蛛侠的真实身份。同时，一位邪恶而强大的章鱼博士又出现在了帕克的面前，给他带来新的挑战。在各种压力下，帕克必须承担起蜘蛛侠的使命。